4.2 Характеристика микроорганизмов, используемых для биологической обработки молочного белково-углеводного сырья

В качестве продуцентов в биотехнологических процессах получения различных пищевых и кормовых продуктов из молочного белково-углеводного сырья, особенно из молочной сыворотки, могут служить разнообразные представители аэробных и анаэробных микроорганизмов, обладающих одним общим для них свойством – способностью утилизировать лактозу. Микроорганизмы, используемые для переработки молочной сыворотки на пищевые продукты, спирты, БАДы и органические кислоты:

Молочнокислые бактерии

Преимущества использования молочнокислых микроорганизмов в молочной промышленности:

- продукты имеют хорошие органолептические показатели и хорошо усваиваются организмом;

- молочная  кислота подавляет рост вредной микрофлоры, что обеспечивает высокую стойкость и диетическую ценность кисломолочных продуктов;

- высокая скорость сбраживания лактозы, а значить и технологических процессов производства кисломолочных продуктов.

Современная таксономия включает два семейства молочнокислых бактерий: Lactobacillaceae и  Streptococcaceae и несколько родов. Каждый род состоит из различных групп, видов и штаммов, различающихся по четырем таксономическим критериям:

1.      морфологические и физиологические характеристики;

2.      химический состав клеточной стенки;

3.      серологическая реакция;

4.      генетические характеристики.

Морфологические и физиологические характеристики. По форме клеток молочнокислые бактерии разделяются на палочки и кокки. Наиболее важный критерий, характеризующий физиологические особенности молочнокислых бактерий – ферментация глюкозы. Термобактерии и стрептобактерии сбраживают глюкозу до D-, L- или  DL- молочной кислоты; бетабактерии – до DL- молочной кислоты, СО₂, уксусной кислоты и спирта; стрептобактерии – до L+ молочной кислоты, лейконостоки  – до D- молочной кислоты, СО₂, уксусной кислоты и спирта.

Химический состав клеточной стенки. Молочнокислые бактерии отличаются друг от друга по типам пептидогликанов. Это различие позволяет идентифицировать различные виды бактерий. Наиболее распространенным типом пептидогликана у лактобактерий является тип L-лизин-D-аспарагиновая кислота (Lb.bulgaricus и  Lb.acidophilus), реже встречаются другие типы: лизин-аланин, лизин-аланин-серин, орнитин-D-аспарагиновая кислота. Str.thermophilus  отличается от  других стрептококков наличием  пептида  L-лизин – L-аланин.

Серологическая реакция (от лат. serum – сыворотка + logos – учение)

Применение серологических методов позволяет на основе антигенной специфичности молочнокислых бактерий, определенной посредством серий перекрестных иммунологических реакций, распределить их в серологические группы.

Генетические характеристики. Результаты ДНК-ДНК гибридизации являются наиболее значимым таксономическим показателем. В большинстве случаев штаммы одного вида дают стабильные гибриды и обнаруживают молекулярную реассоциацию (ре – вновь, снова) более 70 %, что свидетельствует о генетической гомологии и принадлежности к одному виду. При идентификации видов молочнокислых бактерий учитывают генотипические особенности (содержание гуанина с цитозином в ДНК), выраженное в мольпроцентах.

Метаболиты, продуцируемые молочнокислыми бактериями, можно разделить на три группы:

1.           метаболиты, которые действуют как регуляторы развития микроорганизмов;

2.                 метаболиты, оказывающие антибиотическое и бактерицидное действие;

3.                 метаболиты, оказывающие пробиотическое и терапевтическое действие.

Метаболиты-регуляторы. Это молочная кислота и перекись водорода.

Молочная кислота продуцируется в больших количествах и ее концентрация определяет рост как самих молочнокислых бактерий, так и др. микроорганизмов. (Она подавляет рост большинства патогенных и гнилостных бактерий). Например, Lb.bulgaricus замедляет рост, как только рН среды достигает 4,3 – 4,4.

Для всех микроорганизмов характерно наличие оптимальной области рН, в пределах которой наблюдается максимальная скорость роста. Многие типы микроорганизмов имеют оптимум рН в области 5,5 – 7,5. Для дрожжей характерен оптимум рН при 4 – 6. Многие культуры способны расти в более кислой среде, чем оптимальная.

Физиологическая роль оптических изомеров молочной кислоты в организме человека различна. Экзогенная L(+) – молочная кислота легко ассимилируется организмом, играет важную роль в процессах обмена веществ и синтезе некоторых веществ, интенсифицирует клеточное дыхание на 80 %, тогда как L(-) – молочная кислота хуже переносится организмом, может вызвать аллергические реакции, нарушение кислотно-щелочного равновесия организма. Скорость окисления L(-) – молочной кислоты существенно ниже, чем у L(+) – молочной кислоты, она сначала преобразуется под действием фермента дегидрогеназы и только после этого ассимилируется организмом.

ФАО/ВОЗ рекомендует следующие ежедневные нормы потребления L(-) – молочной кислоты: для детей не более 20 мг/кг веса,для взрослых не более  100 мг/кг веса.

Перекись водорода. Некоторые виды микроорганизмов (например, Lb.bulgaricus и Lac. lactis) могут продуцировать перекись водорода в значительных количествах, что способствует подавлению роста бактерий в процессе хранения.

Метаболиты, оказывающие антибиотическое и бактерицидное действие.

Молочнокислые бактерии продуцируют различные низкомолекулярные соединения, имеющие антибиотическое действие:

Метаболиты бактерицидного действия – бактериоцины, облегчают выживание штаммов-продуцентов в условиях смешанных популяций. Бактериоцины – это высокомолекулярные соединения с узким спектром антибактериального действия, которые ингибируют штаммы того же рода и вида, к которому относится продуцент. Максимальное накопление бактериоцинов происходит в конце экспоненциальной фазы роста. Механизм их действия основан на изменении проницаемости клеточной мембраны для ионов калия, магния, кобальта; ингибирование транспортных процессов и синтеза белка, нарушение синтеза РНК, деградация ДНК и т.д. Например, их продуцируют молочнокислые стрептококки (Lac.lactis, Lac.cremoris).

Метаболиты, оказывающие пробиотическое и терапевтическое действие.

Пробиотическое действие молочнокислых бактерий обусловлено:

- молочнокислые микроорганизмы продуцируют метаболиты, способные ингибировать рост нежелательных бактерий (органические кислоты – уксусная, муравьиная, бензойная ингибируют грамотрицательные патогенные микроорганизмы);

- молочная кислота оказывает положительное влияние на процесс переваривания пищи, стимулирует нормальные функции кишечника и, совместно со специфическими антибиотиками, ингибирует рост вредных микроорганизмов;

- различные виды молочнокислых бактерий способны адаптироваться к размножении в  кишечнике, в значительной степени изменяя рост других групп бактерий и создавая условия для их равновесия.

Leuconostoc и палочки вызывающие гетероферментативное брожение, продуцируют уксусную кислоту, Str.thermophilus – муравьиную кислоту, Lb.bulgaricum  и Lb.acidophilum - бензойную кислоту.Способность продуцировать перекись водорода, антибиотики и бактериоцины также является показателем их пробиотического действия.

Терапевтическое действие штаммов определяется следующими свойствами: нетоксичность, устойчивость к веществам, присутствующим в ЖКТ (фенолу, желчи, NaCl, различным уровням кислотности); адгезивная способность; устойчивость к антибиотикам; антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам; продуцирование ферментов, витаминов, полисахаридов и др. Продуцирование гидрокси-метил-глутаровой кислоты, например, препятствует накоплению холестерина, Наличие некоторых веществ в клеточной стенке Lb. bulgaricum определяет антиканцерогенной действие по отношению в саркомам и т.д.

Специфические ферменты активно участвуют в диссоциации желчных кислот, деградации нитрозаминов, гидролизе лактозы и утилизации пищи.

Различные молочнокислые микроорганизмы имеют хорошую способность к прилипанию к эпителию тонкого кишечника, что способствует образованию слоя молочнокислых бактерий, из которого затем происходит постоянная инокуляция кишечника молочнокислыми бактериями и, в то же время, в этом слое сохраняются активные формы молочнокислых микроорганизмов. Кроме того, слой молочнокислых бактерий, примыкающих к эпителию, выполняет защитную роль, что способствует устойчивости организма к заболеваниям, вызываемым энтеропатогенными бактериями.

Клостридии. Используют в биотехнологии, если в качестве субстрата используется молочная сыворотка продуцент Clostridium acetobutylicum Weizmann (палочка Вейцмана). Получают растворитель, рибофлафин. Cl. acetobutylicum – облигатный анаэроб. Клетки размером 0,7х(5…7) мкм располагаются одиночно, парами или короткими цепочками, спорообразующие (споры расположены терминально и субтерминально). Молодые клетки подвижны, имеют жгутики. В старых культурах клетки подвергаются автолизу. Температурный оптимум 37 ^оС, рН 4,7-8.

Уксуснокислые (ацетобактерии) – обладают сильно выраженной способностью к окислению различных органических веществ. При этом происходит не полное окисление органических соединений, и в субстрате накапливается большое количество кислот и кетосоединений. Некоторые культуры способны к синтезу рибофлавина и тиамина. Род Асеtobacter- мелкие прямые или слегка изогнутые палочки (меняют форму и размер под влиянием неблагоприятных условий, иногда встречаются формы разветвленные или имеющие вздутия, а также нитевидные), подвижны, моно- или перитрихи, грам- или грамвариабельны, неспорообразующие, располагаются по одной, в парах, короткие цепочки, строгие аэробы. Температура опт. 30 ^оС мезофилы, любят кислую среду В молоке в чистой культуре не развиваются (лактозу не усваивают). Совместно с молочнокислыми, образующими молочную кислоту, или с дрожжами, образующими спирт, развиваются очень быстро. Наиболее ценные виды уксуснокислых бактерий, образующих уксусную кислоту, являются вид А.асеti, A.orleanense и др.

Дрожжи – одноклеточные, лишенные хлорофилла, немицелиальные грибы, форма разнообразная – яйцевидная (Saccharomyces cerevisiae), эллептическая (Saccharomyces ellipsoideu), цилиндрическая, лимоновидная, шаровидная (Totulopsis). Размер клеток от 2 до 15 мкм, неподвижные, грам+, капсул не образуют; факультативные анаэробы, некоторые дрожжи образуют аскоспоры, которые выполняют репродуктивную функцию. Температура опт 25-30°С, предпочитают кислую среду (рН до 3,5).

Дрожжи, образующие аскоспоры называются истинными дрожжами, не образующие – нетипичными дрожжами или дрожжеподобными грибами. Такое деление несовершенно и не отражает многие физиологические признаки организма.

Cпорообразующие дрожжи делят на три семейства: Saccharomycetaceae, Saccharomycodaceae, Schizosaccharomycetaceae. Наибольший практический интерес имеют дрожжи семейства Saccharomycetaceae и среди них род Saccharomyces.

Неспоробразующие дрожжи относятся к семейству Cryptococcaceae, которые делятся на три подсемейства : Cryptococcoideae, Trichosporoideae  и Rhodotoruloideae. Представители первого подсемейства – дрожжи родов Torulopsis и Candida,  второго -  Trichosporon и  третьего – Rhodotorula.  Представители всех трех родов находят применение при биотехнологической переработки молочной сыворотки.

Типичные виды дрожжей, сбраживающих лактозу: спорообразующие (аскомицеты) Saccharomyces lactis, Kluyveromyces fragilis, неспорообразующие  Torulopsis kefir, Candida lactis.

Плесени – сложные многоклеточные микроорганизмы, активно разлагают углеводы, жиры и некоторые белки, относятся к аэробам, развиваются при рН 4…5,5, при различном осмотическом давлении и температурах.  Большинство плесневых грибов образуют пушистые колонии разного цвета, обусловленного наличием пигмента в протоплазме мицелия или в воздушных спорах.

Плесневые грибы делят на 4 больших класса: фикомицеты (Rhyzopus, Blakeslea и Phycomyces), обычно с несепрированным мицелием; базидиомицеты, обладающие сепрированным мицелием и образующие половые экзогенные (внешнего происхождения) споры на базидиях; аскомицеты (Sclerotinia, Ashbya, Eromothecium), имеющие сепрированный мицелий и образующие эндогенные половые споры в сумках (асках); несовершенные грибы (Aspergillus, Penicillium, Geotrichum и др.), которые обладают сепрированным мицелием, но не образуют половых спор.

Ферментативный гидролиз белков молочной сыворотки

При гидролизе сывороточных белков протеолитическими ферментами получают гидролизаты сывороточных белков. Гидролиз белков молочной сыворотки до пептидов и аминокислот осуществляют для повышения биологической ценности вырабатываемых продуктов или из-за требований технологического процесса, например при изготовлении напитков из сыворотки. При этом кроме повышения их питательной и биологической ценности (обогащение аминокислотами) улучшается качество (прозрачность и отсутствие осадка) готовых продуктов. Кроме того, потребление продуктов с расщепленными сывороточными белками рекомендуется людям, страдающих некоторыми заболеваниями ЖКТ и аллергией (у некоторых людей бывает аллергия к бета-лактоглобулину).

Источниками протеолитических ферментов могут быть растения, животные и  микроорганизмы.

Источники протеолитических ферментов растительного происхождения – листья папайи, плоды дынного дерева, побеги и листья инжира и отходы переработки ананасов. Например, папаин и химопапаин – ферменты латекса плодов дынного дерева. Фермент фицин - млечный сок инжира и бромелаин - свежий сок ананаса.

Протеолитические ферменты животного происхождения – пепсин, ренин, панкреатин и др., выделяемые из желудочно-кишечного тракта убойных сельскохозяйственных животных.

Большинство микроорганизмов обладает протеолитической активностью. В нашей стране наиболее известный микробный протеолитический фермент, выпускаемый в промышленных масштабах – протосубтилин. Ферменты из различных микроорганизмов обладают не только разной протелитической активностью, но и образуют разные продукты гидролиза. Глубокий протеолиз может сопровождаться образованием нежелательных, часто дурно пахнущих и ядовитых веществ. При использовании таких ферментов необходимо применять специальные технические приемы, препятствующие образованию этих веществ. для улучшения органолептических показателей необходимо добавление вкусовых и ароматических веществ, маскирующих неприятные тона во вкусе.

Наиболее целесообразно использовать ферменты специфически расщепляющих сывороточные белки без образования нежелательных продуктов гидролиза. Это ферменты, продуцируемые молочнокислыми микроорганизмами. Способность к протеолизу является одним из биохимических свойств молочнокислых бактерий. Поскольку растворы, содержащие сывороточные белки, являются природным субстратом протеолитических ферментов молочнокислых бактерий, протеолиз проходит специфически мягко.

По эффективности гидролиза белков молочной сыворотки протео-литические ферменты можно расположить в следующий ряд (% гидролиза):

В гидролизованной протеолитическими ферментами молочной сыворотке содержится весь набор аминокислот, заметно увеличивается их содержание в сравнении с исходной сывороткой, особенно лейцина и глутаминовой кислоты. Появляются оксиаминокислоты (серии и треонин), двухосновные (гистидин, аргинин), а также ароматические и серосодержащие аминокислоты.

Из молочной сыворотки после гидролиза белков можно готовить сгущенные и сухие обогащенные концентраты. В последние годы разработаны эффективные способы гидролиза концентратов  сывороточных белков, выделенных из молочной сыворотки тепловой денатурацией и ультрафильтрацией. За рубежом на этой основе готовят сухой быстрорастворимый продукт с фирменным названием "Сан-Бол".

В производстве молочного сахара гидролиз белков позволяет улучшить его качество и стабилизировать технологический процесс.

На основе ферментации молочной сыворотки можно приготовить белковые гидролизаты для микробиологических исследований.