3.2 Лабораторные исследования

Определение степени чистоты молока (ГОСТ 8218-89). Устанавливают количество механических примесей фильтрованием 250 мл молока через ватные или фланелевые фильтры диаметром 27-30 мм, установленные в приборе «Рекорд». Перед исследованием молоко тщательно перемешивают, подогревают до температуры 35±5 ⁰С и пропускают через фильтр. После этого фильтр вынимают и помещают на чистый белый лист бумаги, где, сравнивая со стандартом, устанавливают группу чистоты молока.

Оценка результатов. Молоко первой группы не имеет механических примесей (для сырого молока допускается наличие на фильтре не более двух частиц), второй – имеет отдельные частицы (до 13), третьей – заметный остаток мелких и крупных частиц.

Определение плотности (ГОСТ 3625-84). Плотность молока определяют при помощи ареометра (лактоденсиметра) не ранее, чем через 2 часа после дойки. В цилиндр по стенке осторожно наливают 250 - 500 мл перемешанного молока, измеряют его температуру, а затем в пробу медленно опускают ареометр, таким образом, чтобы он не касался стенок цилиндра. Через 3 минуты производят отсчеты по шкалам термометра и ареометра.

Плотность исследуемой пробы молока вычисляют как среднее арифметическое двух показании ареометра с учетом поправки на температуру молока. При температуре молока 20 ⁰С, показания ареометра соответствуют истинной плотности, если же она выше 20 ⁰С, то поправку в 0,2 ⁰А на каждый градус разницы в температуре берут со знаком «плюс», если ниже – со знаком «минус».

Оценка результатов. Кондиционное коровье молоко должно иметь плотность не менее 1027,0 кг/м³.

Определение кислотности с применением индикатора фенолфталеина (ГОСТ 3624-92). Метод основан на нейтрализации кислот, содержащихся в продукте, раствором гидроокиси натрия в присутствии фенолфталеина.

В коническую колбу емкостью 150 - 200 мл с помощью пипетки отмеривают 10 мл молока, прибавляют 20 мл дистиллированной воды и 3 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. Смесь тщательно перемешивают и титруют 0,1Н раствором гидроокиси натрия (калия) до появления слабо-розового цвета, соответствующего контрольному эталону окраски (приготовленному из раствора сернокислого кобальта), не исчезающего в течение 1 минуты. Кислотность молока (в градусах Тернера) равна количеству миллиметров 0,1 Н раствора гидроокиси натрия (калия), затраченного на нейтрализацию 10 мл молока, умноженному на 10.

В отдельных случаях кислотность молока можно определять без добавления воды, полученную при этом кислотность понижают на 2 ⁰Т.

Для приготовления контрольного эталона окраски в коническую колбу наливают 10 мл молока и 1 мл 2,5 %-ного сернокислого кобальта. Эталон пригоден для работы в течение суток.

Оценка результатов. Кислотность коровьего молока должна быть в пределах 16, 0 – 21,0 ⁰ Т.

Проба кипячением. Свежесть молока можно определить кипячением в пробирке. Молоко, имеющее кислотность выше 26 ⁰Т, при кипячении в пробирке свертывается. С помощью этой пробы выясняют, можно или нет пастеризовать молоко. Кроме того, проба кипячением дает возможность отличить свежее молоко от смешанного, в котором имеется часть молока с повышенной кислотностью. Например, при анализе смеси молока кислотностью 27 ⁰ и 18 ⁰Т проба кипячением положительна (молоко свертывается), хотя титруемая кислотность его может не превышать 22 ⁰Т.

Определение содержания жира (ГОСТ 5867-90). Метод основан на выделении жира из молока под действием концентрированной серной кислоты и изоамилового спирта с последующим центрифугированием и измерением объема выделившегося жира в градуированной части жиромера.

В молочные жиромеры, стараясь не намочить горлышко, наливают по 10 мл серной кислоты плотностью 1,81 - 1,82 г/см³ и добавляют специальной пипеткой по 10,77 мл перемешанного молока (выдувание молока из пипетки не допускается), затем вносят по 1 мл изоамилового спирта плотностью 0,811 - 0,812 г/см³. Жиромеры закрывают сухими пробками, вводя их более чем наполовину в горлышки жиромеров. Смешивание молока с кислотой сильно разогревает смесь, поэтому жиромеры обертывают полотенцем и многократно переворачивают до полного растворения белковых веществ. Движением резиновой пробки регулируют столбик жидкости в жиромере так, чтобы его верх находился в трубке со шкалой. После этого жиромеры ставят пробками вниз на 5 минут в водяную баню с температурой 65 ± 2⁰С. Вынув из бани, их вставляют в патроны центрифуги узкой частью к центру, располагая симметрично один против другого для уравновешивания центрифуги. Центрифугу закрывают крышкой, и пробы центрифугируют в течение 5 минут со скоростью не менее 1000 об/мин. Затем жиромеры вновь погружают в водяную баню (с температурой 65±2 ⁰С), уровень воды в которой должен быть выше уровня жира в жиромере. Через 5 минут проводят отсчет содержания жира по нижнему мениску, причем граница раздела жира и кислоты должна быть четкой, а столбик жира прозрачным.

Показания жиромера соответствуют содержанию жира в молоке в процентах. Объем малых делений шкалы молочного жиромера соответствует 0,1% жира. Отсчет жира ведут с точностью до одного маленького деления жиромера. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,1% жира. За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Добавление небольшого количества серной кислоты в жиромеры (при большом их объеме) не влияет на результаты определения.

Оценка результатов. Массовая доля жира в коровьем молоке должна быть не менее 2,8 %.

Бактериальная обсемененность молока по редуктазной пробе с метиленовым голубым (ГОСТ 9225-84). Редуктаза - это окислительно-восстановительный фермент, выделяемый микроорганизмами в процессе жизнедеятельности. Метод основан на восстановлении метиленового голубого окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Для микробиологических анализов из объединенной пробы молока выделяют пробу в объеме 50 – 60 мл и помещают в стерильную посуду с помощью стерильных приспособлений.

Для проведения редуктазной пробы с метиленовым голубым готовят водный раствор с массовой концентрацией метиленового голубого 0,005 г/см³. Для этого 0,5 г метиленового голубого переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят метки прокипяченной и охлажденной до 25 ± 2⁰ С водой. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения. Срок хранения раствора не более 12 месяцев в банках, защищенных от света.

Для приготовления рабочего раствора с концентрацией 0,00015 г/ см³. Берут 6 мл первого раствора и смешивают со 194 мл дистиллированной воды. Срок хранения рабочего раствора не более 30 суток в холодильнике.

В пробирки наливают по 1 мл рабочего раствора метиленовой сини и по 20 мл исследуемого молока, закрывают пробками, смешивают и ставят в редуктазник с температурой воды 37 ⁰С или в водяную баню. Наблюдение за изменением окраски ведут через 40 минут, 2,5 часа и 3,5 часа после погружения пробирок в редуктазник. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания окраски молока, при этом оставшийся небольшой кольцеобразный слой наверху ( шириной не более 1 см) или небольшую окрашенную часть внизу пробирки в расчет не принимают, окрашивание молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

Оценка результатов. В зависимости от времени обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов (таблица 1).

Таблица 1 Оценка качества молока по редуктазной пробе

Определение содержания белка (ГОСТ 25179-90). Содержание белка в молоке определяется тремя методами: формольным титрованием, рефрактометрическим и колориметрическим. Содержание белка данными методами может быть определено в непастеризованном молоке с кислотностью не выше 20 ⁰Т.

Метод формольного титрования основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

В химический стакан наливают 10 мл исследуемого молока (неконсервированного), добавляют 10 – 12 капель 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,1Н раствором гидроокиси натрия (калия) до слабо-розового окрашивания, соответствующего эталону. Затем вносят 2 мл нейтрализованного (по фенолфталеину) свежеприготовленного формалина и вновь титруют до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 1 минуты. Количество 0,1 Н раствора щелочи, пошедшей на титрование в присутствии формалина, умножают на коэффициент 1,92 и получают содержание белка в молоке в процентах.

Для получения нейтрального формалина, к нему добавляют несколько капель фенолфталеина и по каплям 0,1 Н раствор щелочи до появления устойчивого бледно-розового окрашивания.

Рефрактометрический метод основан на измерении показателей преломления молока и безбелковой молочной сыворотки, полученной из того же образца молока, разность между которыми прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

В пенициллиновый флакон отмеривают 5 мл молока, добавляют 6 капель 4 %-ного раствора хлористого кальция и закрывают резиновой пробкой. После легкого встряхивания флакон помещают в кипящую водяную баню на 10 минут, затем охлаждают до 20 ⁰С холодной водой. Вынутый из бани флакон вытирают и встряхивают так, чтобы конденсат на стенках и пробке перемешался с сывороткой. При нагревании все белковые вещества должны быть в осадке. Флаконы помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 минут. Сыворотку отсасывают в стеклянную трубку через ватный тампон. 1 - 2 капли сыворотки наносят на призму рефрактометра. Закрыв призму и направив в окно верхней оправы световой луч, отсчитывают показания сыворотки с призмы и наносят 2 капли исследуемого молока. Отсчет проводят также по шкале «белок». При отсчете показаний визирную линию необходимо совмещать с границей светотени так, чтобы линии не оставляли между собой зазора.

Определяют процент белков в молоке по разности показателей, полученных при нанесении сыворотки и молока на призму. Если, например, показатель отсчета по шкале при нанесении на призму молока равен 9,7, а сыворотку 6,4, то содержание белков в исследуемом молоке составляет 9,7 - 6,4=3,3 %.

Колориметрический метод. Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора, которая уменьшается пропорционально массовой доле белка. Измерение процентного содержания белка в молоке проводят с помощью прибора фотоэлектроколориметра. Методика подробно изложена в ГОСТ 25179-90 «Молоко. Методы определения белка».

Оценка результатов. Массовая доля белка в коровьем молоке должна быть не менее 2,8 %.

Определение содержания сухого вещества в молоке (ГОСТ 3626-73). Содержание сухих веществ в молоке коров составляет – 11,3 - 14,5 %, овец – 14,6 - 23,3, коз – 10,8 - 18,2, кобыл – 10,2 - 11,1 %.

Сущность методов определения массовой доли влаги и сухого вещества в молоке основана на высушивании навески исследуемого продукта при постоянной температуре.

Стеклянную бюксу с 20 - 30 г хорошо промытого и прокаленного песка и стеклянной палочкой, не выступающей за края бюксы, помещают в сушильный шкаф и выдерживают при 102 ±2 ⁰С в течение 30 - 40 минут, после чего бюксу вынимают из сушильного шкафа, закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе 40 минут, а затем взвешивают с точностью до 0,001 г. В эту же бюксу пипеткой вносят 10 мл молока. Открытую бюксу нагревают в водяной бане, содержимое перемешивают, затем помещают в сушильный шкаф с температурой 102 ± 2⁰С. Через 2 часа бюксу вынимают из сушильного шкафа, закрывают крышкой и в течение 40 минут охлаждают в эксикаторе, а затем взвешивают.

Последующие высушивания и взвешивания проводят до тех пор, пока разность между двумя последовательными взвешиваниями будет равна или меньше 0,001 г. Содержание сухого вещества (С, %) вычисляют по формуле 1.

(1)

где М₀ – масса бюксы с песком и стеклянной палочкой, г; М – масса бюксы с песком, стеклянной палочкой и навеской молока до высушивания, г; М₁ - масса бюксы с песком, стеклянной палочкой и навеской молока после высушивания, г.

За окончательный результат исследования принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми должно быть не более 0,1%.

Определение сухих обезжиренных веществ в молоке. В кондиционном молоке содержание сухих обезжиренных веществ составляет не менее 8,2 %. При денатурации молока водой данный показатель снижается ниже 8 %, а при частичном снятии жира он обычно бывает в пределах нормы.

Содержание сухого обезжиренного вещества в молоке (С₀, %) определяют по формуле 2.

С₀=С - Ж, (2)

где С –массовая доля сухого вещества, %; Ж – массовая доля жира, %.

Определение наличия анормального молока в сборном (ГОСТ 23453-90). Анормальное молоко – такое молоко, в котором количество соматических клеток превышает 1 млн. в 1 мл (при субклинических маститах, примеси молозива или молока стародойных коров и т.п.).

Метод основан на взаимодействии препарата «Мастоприм» с соматическими клетками, в результате которого изменяется консистенция молока.

В лунку пластинки ПМК – 1 вносят 1 мл молока и добавляют 1 мл 2,5%-ного раствора препарата «Мастоприм». Молоко с препаратом интенсивно перемешивают палочкой в течение 10 секунд. Полученную смесь из лунки неоднократно поднимают палочкой вверх на 5 - 7 см, после чего в течение минуты оценивают результаты анализа.

Наличие примеси анормального молока в сборном устанавливают по изменению консистенции молока в соответствии с данными, указанными в таблице 2.

Для приготовления 2,5 %-ного водного раствора препарата «Мастоприм» 2,5 г препарата вносят в мерную колбу объемом 100 мл и доливают до метки дистиллированной водой, нагретой до температуры 30 – 35 ⁰С. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка.

Таблица 2 Оценка результатов визуального метода определения количества соматических клеток в молоке

Определение ингибирующих веществ (ГОСТ 23454-79). К ингибирующим веществам относят антибиотики, формалин, перекись водорода, моющие, дезинфицирующие и консервирующие средства.

Методы определения наличия ингибирующих веществ с индикаторами резазурином или метиленовым голубым основаны на их восстановлении при развитии в молоке чувствительного к ингибирующим веществам термофильного стрептококка. Исследования проводят в специализированных ветеринарных лабораториях, куда направляют пробы неконсервированного молока в обычных количествах.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке содержание пенициллина более 0,01 МЕ/мл, массовую долю формалина – около 0,005 %, массовую долю перекиси водорода – более 0,01 %, стрептомицина 10 мкг/мл и тетрациклина 1 мкг/мл.

Определение натуральности молока. Чтобы выявить, фальсифицировано молоко или нет, необходимо в его стойловой и исследуемой пробах знать содержание жира, сухого вещества, сухого обезжиренного остатка (СОМО) и плотность.

Наиболее частые случаи фальсификации молока – разбавление водой, прибавление обезжиренного молока и воды (двойная фальсификация), крахмала, муки. Степень фальсификации рассчитывают по соответствующим формулам.

При добавлении в молоко воды снижается содержание сухого вещества, СОМО, жира и плотность.

Содержание добавленной воды (В, %) рассчитывают по формуле 3.

(3)

где СОМО – сухой обезжиренный молочный остаток стойловой пробы, %; СОМО₁ - сухой обезжиренный молочный остаток исследуемой пробы, %.

При фальсификации молока водой его плотность снижается на 1 ⁰А на каждые 3 % прибавленной воды.

Прибавление воды можно установить нитратной пробой. Проба основана на том, что колодезная, речная, прудовая вода содержит нитраты (соли азотной кислоты), а в натуральном молоке они отсутствуют.

В пробирку наливают 2 мл концентрированной, химически чистой серной кислоты; в другую – 2 мл молока, добавляют каплю формалина, размешивают и осторожно по стенке переносят молоко в пробирку с кислотой. Если на границе соприкосновения кислоты и молока образуется сине-фиолетовое кольцо, значит, в молоко добавлена вода. В натуральном молоке кольцо не образуется.

Определяют также прибавление обрата или подснятие части сливок. При добавлении обезжиренного молока или подснятия жира плотность молока повышается, содержание жира и сухого вещества снижается, а СОМО не изменяется или слегка повышается.

Содержание прибавленного обрата (О, %) рассчитывают по формуле 4.

(4)

где Ж – содержание жира в стойловой пробе, %; Ж₁ - содержание жира в исследуемой пробе, %.

Двойную фальсификацию устанавливают, если к молоку добавлены вода и обезжиренное молоко. В этом случае уменьшается содержание сухого вещества, СОМО, жира, плотность же не изменяется или изменяется незначительно.

При установлении общего количества добавленных воды и обрата (Д, %), воды, добавленной к молоку (В, %), добавленного обезжиренного молока (О, %) применяют формулы 5, 6 и 7.

(5)

(6)

(7)

где Д – общее количество добавленных воды и обрата, %; Ж – содержание жира в стойловой пробе, %; Ж₁ – содержание жира в исследуемой пробе, %; СОМО – сухой обезжиренной молочный остаток стойловой пробы, %; СОМО₁ – сухой обезжиренный остаток исследуемой пробы, %.

Сода может оказаться в молоке в результате добавления для снижения его кислотности или неправильного ухода за молочной посудой. Определение проводят по ГОСТ 24065-80. Метод основан на изменении окраски раствора индикатора бромтимолового синего при добавлении его в молоко, содержащее соду (карбонат или бикарбонат натрия). Чувствительность метода позволяет установить добавление 0,05% соды.

В пробирку наливают 5 мл исследуемого молока и осторожно по стенке добавляют 7 - 8 капель (0,1 мл) 0,04%-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Через 10 минут наблюдают за изменением окраски кольцевого слоя, не допуская встряхивания пробирки. Желтая окраска указывает на отсутствие соды. Появление зеленой окраски (от светлой до темной) свидетельствуют о присутствии соды.

В молоко могут быть добавлены крахмал и мука. Для установления этой фальсификации в пробирку наливают 5 мл молока и добавляют 2 - 3 капли раствора йода, а затем содержимое встряхивают. Появление синей окраски в молоке свидетельствует о присутствии крахмала (мука).

Пробирочный метод можно заменить капельным. Реакцию ставят на стекле, смешивая каплю реактива с каплей молока.

Контроль пастеризации молока. Молоко, поступающее с молочных заводов в торговую сеть, а также из ферм неблагополучным по заразным болезням подвергают пастеризации. На молочных заводах пастеризуют также обезжиренное молоко, возвращаемое хозяйствам для скармливания животным.

При пастеризации свойства молока несколько изменяются: некоторые соли выпадают в осадок и переходят в нерастворимые формы, свертываются сывороточные белки, разрушаются ферменты и т.д.

В основе методов установления пастеризации молока лежат исследования, предусмотренные ГОСТ 3623-73, основанные на выявлении в молоке сывороточных белков и некоторых ферментов (пероксидаза, фосфатаза).

Сущность реакции на пероксидазу с йодисто-калиевым крахмалом заключается в разложении перекиси водорода ферментом молока пероксидазой. Освобождающийся при этом активный кислород окисляет йодистый калий, освобождая йод, образующий с крахмалом соединение синего цвета.

В пробирку наливают 5 мл молока, добавляют 5 капель раствора йодисто-калиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода. После вливания каждого реактива содержимое пробирки тщательно перемешивают. Если цвет содержимого пробирки не изменился – молоко пастеризовано правильно. Окрашивание содержимого пробирки в синий цвет свидетельствует о том, что молоко пастеризовано с нарушением режима или к правильно пастеризованному добавлено сырое молоко.

Лактоальбуминовую пробу используют для установления пастеризации молока при температуре выше 80⁰С. При этой температуре альбумин свертывается и в сыворотке молока его не будет.

В колбе смешивают 5 мл молока и 20 мл воды, добавляют 3 мл 0,1 Н раствора серной кислоты для осаждения казеина и отфильтровывают. В пробирку вносят около 5 мл прозрачного фильтрата и кипятят. Если молоко пастеризовано при 80⁰С, то при его кипячении не должно быть хлопьев альбумина, а при охлаждении фильтрата не будет осадка.

Исследование на мастит. Для контроля за состоянием молочной железы руководствуются Методическими указаниями по диагностике, лечению и профилактике маститов у коров. Для диагностики скрыто протекающих маститов ставят пробы с димастином или мастидином. Если эти реакции положительные, их уточняют пробой отстаивания. Бромтимоловая проба для диагностики маститов не рекомендуется, так как она недостаточно объективна.

При заболевании вымени в молоке увеличивается число лейкоцитов и появляется щелочная реакция (рН 7,0 и выше), что устанавливают с помощью димастина и мастидина. Последние содержат поверхностно-активные вещества, которые, взаимодействуя с лейкоцитами, образуют сгусток, а индикатор изменяет цвет в зависимости от реакции среды (рН).

Проба с димастином. В луночки специальной пластинки от каждой доли вымени наливают по 1 мл молока последней порции удоя, добавляют по 1 мл 5%-ного раствора димастина. Содержимое луночки перемешивают стеклянной палочкой. Молоко, полученное от коров, больных маститом, образует плотный тягучий сгусток ярко – красного цвета. Если получается сгусток желеподобной консистенции красного цвета, то считают, что молоко получено от коров, подозрительных по заболеванию маститом. Нормальное молоко остается однородным, цвет его оранжево – красный.

Пробу с мастидином проводят так же, как с димастином. Реакцию учитывают главным образом по густоте желе. Положительная реакция – сгусток похож на белок куриного яйца фиолетового или темно – сиреневого цвета; отрицательная – однородная жидкость или слабый сгусток светло – сиреневого, дымчатого цвета.

Проба отстаивания. В пробирку наливают 10 - 15 мл молока и отстаивают в течение 16 - 18 часов на холоде. На второй день учитывают реакцию. В молоке коров, больных маститом, на дне пробирке образуется осадок с желтоватым или синеватым оттенком, высотой 0,1 см и более, а также уменьшается слой сливок слизистой консистенции. Молоко от здоровых коров осадка не образует. Если проба отстаивания дает сомнительные результаты, то для уточнения диагноза молоко направляют на исследования в ветеринарную лабораторию, где определяют число лейкоцитов, активность каталазы и лизоцимов, исследуют бактериологически.

Исследование на бруцеллез. При заболевании коров бруцеллезом в молоке появляются антитела, которые при добавлении к молоку бруцеллезного антигена склеиваются (реакция агглютинации) и адсорбируются на жировых шариках.

Кольцевую пробу ставят следующим образом. В пробирку наливают 1 мл молока и добавляют 1 каплю цветного бруцеллезного антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином). Пробирку с содержимым встряхивают и помещают в термостат при 37⁰С на 40 - 45 минут. Положительная реакция характеризуется появлением в верхнем слое жидкости кольца синего цвета: сомнительная – кольцо слабо окрашено, синеватое: отрицательная – содержимое пробирки равномерно окрашено.

Люминесцентный анализ. Обязательным условием при определении качества молока является одновременный просмотр нескольких проб молока, из которых одна заведомо хорошего качества, иначе разница в цвете люминесценции не будет заметна. Пробы молока наливают в кюветы по 10 – 20 мл и помещают в смотровую камеру. Цельное коровье молоко люминесцирует интенсивным желтым цветом.

Кипяченое молоко люминесцирует таким же желтым цветом, но оно более прозрачное (менее насыщенное). Молоко, начинающее скисать, дает люминесценцию серо-голубого цвета различной насыщенности. Цельное молоко, разбавленное водой, меняет свой цвет с ярко-желтого до бледно-желтого.